- 影響因素
從酶活定義中我們可以看出，影響酶活性實驗的主要因素有溫度、pH、時間。
學(xué)過酶工程的小伙伴應(yīng)該很清楚，酶活性實驗的本質(zhì)還是酶促反應(yīng)嘛，所有影響酶促反應(yīng)的因素都同樣影響酶活性實驗。
1、溫度：一般來說，在一定溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速度隨溫度的增高而加快，但當(dāng)溫度增加達到某一點后，由于酶蛋白的熱變性作用，反應(yīng)速度迅速下降。酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而達到一最大值時的溫度就稱為酶的最適溫度。
所以，我們在做酶活性實驗的時候，一定要嚴(yán)格的控制反應(yīng)溫度，保證同一批樣品都在相同的溫度下進行，可以選擇水浴或金屬浴保溫。溫度最好選擇在最適溫度，如果無法判斷最適溫度，那就遵循哺乳動物樣本37℃，其他樣本25℃的原則。當(dāng)然，對于一些反應(yīng)時間很短的酶活實驗，很難嚴(yán)格控溫，可以在室溫下反應(yīng)（室溫在20-40℃），保證一批樣品測定過程中室溫穩(wěn)定一致。
2、pH：pH對酶促反應(yīng)速度的影響，通常為一鐘形曲線，即pH過高或過低均可導(dǎo)致酶催化活性的下降。酶催化活性最高時溶液的pH值就稱為酶的最適pH。
酶活檢測實驗中通常會選擇在最適pH下進行，pH由緩沖液或底物提供，如pH6.8的PBS緩沖液、pH7.4的生理鹽水、pH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液等。一般參考指導(dǎo)書或試劑盒說明書即可。如果無法確定最適pH，那就用7.0-7.4吧，適合大部分酶。
3、時間：時間對酶促反應(yīng)的影響主要體現(xiàn)在反應(yīng)速率的變化和反應(yīng)階段的劃分上。酶促反應(yīng)過程中，時間會影響反應(yīng)的速率和進程，主要分為延滯期、線性期和非線性期三個階段。在延滯期，酶與底物結(jié)合需要一定的時間，反應(yīng)速率較慢。在線性期，酶促反應(yīng)速度達到并保持恒定速率進行反應(yīng)。此時，反應(yīng)速率不受底物濃度的影響，酶活性與反應(yīng)速率成正比，是酶活性測定的最佳時期。這段時間一般為1到5分鐘（可能更長）。隨著反應(yīng)時間的延長，底物消耗越來越明顯，反應(yīng)速率逐漸下降，進入非線性期。
線性期是酶活性測定的最佳時期。如葉片的POD酶活性檢測，通常選擇30s-2min30s作為最佳測定時間。不同酶的線性期也不同，一般參考指導(dǎo)書或試劑盒說明書。
4、酶液濃度和酶液用量：在底物濃度足夠大，足以使酶飽和的情況下，酶促反應(yīng)的速度與酶濃度成正比。
酶活檢測實驗中，如果遇到OD值變化很小的情況，可以適當(dāng)增加酶液用量（體積）或增大酶液濃度（重新提取酶液，減少提取液用量）。
在酶活檢測實驗中，除了上述4個影響因素外，還有底物濃度、金屬離子等也能影響酶促反應(yīng)。這些在指導(dǎo)書或試劑盒中已經(jīng)準(zhǔn)備好了，不做過多說明。
值得注意的是：同一批樣品一定要保證所用試劑的pH、底物濃度、金屬離子等一致，如果一批樣品檢測要用多個同貨號的試劑盒，要將相同組分提前混勻，以消除試劑盒配置的批次誤差。如果是自配試劑也一樣操作。
